СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ СОСТОЯНИЯ СТРЕССА

У СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ПТИЦ

Ю.И. Забудский*

Российский государственный аграрный заочный университет, ул.Фучика, 1,

143900 Балашиха, Россия

Резюме: Сделан критический анализ методов диагностики стресса у птиц, обсуждаются достоинства метода, предложенного автором.

Ключевые слова: диагностика, птицы, стресс.

ВВЕДЕНИЕ

Использование промышленных технологий в птицеводстве существенно интенсифицировало производство диетической пищевой продукции. Однако, при интенсивных технологиях имеют место ситуации, вызывающие развитие состояния стресса у поголовья и появления характерных нозологических единиц, в т.ч. гипокинезии, истерии, синдрома жирной печени, иммунодефицитов и др.( Бессарабов, 1983; Киселев, 1983; Болотников И.А., Конопатов Ю.В, 1987; Данилова, Найденский, 1989; Фисинин,Столляр,1989; Gross, Siegel, 1983; Freeman, 1987). Для рационального планирования и проведения ветеринарных и технологических мероприятий, адекватного применения средств профилактики стресса необходим постоянный мониторинг за состоянием организма птиц. Для этого нужны маркеры, т.е. показатели функционального состояния клеток и органов или их систем, характеристики которых закономерно изменяются при развитии постстрессорной реакции и могут быть использованы в качестве индикаторов. Существующие методы, применяемые с этой целью, принято классифицировать на три группы: физиологические, этологические и показатели продуктивности (Hill, 1983). Однако, большинство из них имеют свои недостатки, что требует от исследователя очень осторожного выбора маркеров.Физиологические тесты принято делить на прямые и косвенные. Первые включают определение медиаторов и гормонов, выделяемых в кровь вследствие возбуждения нейро-эндокринной системы. Однако, концентрация этих биологических активных веществ настолько лабильна, что собственно процесс отбора проб крови уже приводит к ее значительному увеличению (Freeman, 1977).

Исследователи часто используют в своих наблюдениях один из косвенных физиологических тестов – соотношение гетерофилов и лимфоцитов, циркулирующих в крови птиц (Семен, Демчук, 1985; Забудский, Скутарь, 1993; Gross, 1984; Gross, Siegel, 1983; Beuving G., Jones R., Blockhius H., 1989. Утановлено, что соотношение Г/Л в периферической крови увеличивается за счет числа гетерофилов и уменьшения числа лимфоцитов пропорционально степени действия различных стресс-факторов (вакцинация, социальный стресс) и коррелирует с изменением уровня кортикостерона в плазме крови.

Доказано, что соотношение Г/Л более объективный тест, чем концентрация этого гормона, т.к. величина искомого соотношения менее лабильна, а процедура отбора проб крови не вызывает изменения соотношения этих клеток, как это происходит с концентрацией кортикостерона. Кроме того, многочисленными исследованиями показано, что гормональный статус имеет циркадный ритм, а у несушек определяется еще и фазой формирования яйца (Известно, что иммунная система животных, в частности, птиц опосредованно участвует в развитии стресс-реакции, а показатели ее функционального состояния считаются перспективными в качестве маркеров состояния напряжения организма (Siegel, 1985). Установлено, что вследствие развития стресс-реакции нарушается синтез интерлейкинов и изменяется кооперация отдельных популяций лимфоцитов.

В связи с изложенным можно предположить, что действие стресс-факторов вызывает не только изменение величины соотношения Г/Л, но и их функционального состояния, возможно, миграционной активности лейкоцитов. Поэтому нами проведены наблюдения за изменением кинетики данного показателя у цыплят в состоянии покоя и стресса.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Исследования проведены на цыплятах в условиях промышленных птицефабрик.

Пробы крови отбирали из крыловой вены в сухие обезжиренные пробирки, орошенные раствором лимоннокислого натрия. Соотношение гетерофилов и лимфоцитов Г/Л исследовали на мазках периферической крови, окрашенных по прописи Паппенгейма, с использованием красителей Май-Грюнвальда и Романовского-Гимза (Ромейс, 1953).

Миграционную активность лейкоцитов (МАЛ) периферической крови определяли капиллярным способом ( Баева, Бешлей, 1982, Болотников, Конопатов, 1987) в нашей модификации.

Определенный объем крови, например, 0,3 мл смешивали в пробирке с равным объемом раствора Хенкса. Осторожно пипетировали полученную смесь и инкубировали в термостате при 37° С в течение 30 мин. Извлекали из термостата, еще раз пипетировали в стеклянные капилляры с внутренним диаметром 1,0-1,5 мм, длиной 40-50 мм. Один из концов последнего заклеивали смесью воска и пластилина и центрифугировали при 3000 об/мин. в течение 15-20 мин.

По окончании центрифугирования капилляры с содержимым расслоившимся на форменные элементы и жидкую часть, состоящую из плазмы и раствора Хенкса, с помощью пластилина укрепляли на предметном стекле. На микроскопе МБС-9, оснащенном микрометром, производили измерения длины столба форменных элементов. Предметные стекла с капиллярами в горизонтальном положении помещали в термостат при 37° С на инкубацию в течение 16-18 ч. Следует иметь в виду, что при увеличении продолжительности инкубации в капилляре образуются пузырьки воздуха, что затрудняет дальнейшие измерения и уменьшает точность определения МАЛ.

По завершении инкубации предметные стекла с капиллярами извлекали из инкубатора и проводили повторное измерение длины столба форменных элементов. Вследствие миграции лейкоцитов длина последнего увеличивается за счет образовавшегося конуса, состоящего из лейкоцитов, мигрировавших в сторону смеси плазмы и раствора Хенкса. Определив разницу между данными второго и первого измерения, и, выразив ее в миллиметрах, получили данные о величине МАЛ у соответствующей особи.

Для того, чтобы оценить возможное закономерное изменение величины МАЛ при стрессе, а также определить информативность этого показателя, мы провели сравнительное исследование кинетики соотношения Г/Л и МАЛ у цыплят, находящихся в состоянии покоя и стресса.

В двух сериях опытов использовали два различных по природе стресс-фактора: действие пониженной температуры или голодание и жажду.

Опыт проводили на 20-дневных цыплятах, отобранных по методу аналогов, содержащихся в птичнике при температуре 28-29° С.

После пятидневного подготовительного периода у всех особей отбирали пробы крови из крыловой вены. Затем 15 голов опытной группы поместили в картонные коробки перенесли в помещение с температурой 10° С, где выдерживали в течение 2 ч. Другие 15 голов, составляющих контрольную группу, переместили в другое помещение, где температура была такой же, как и в птичнике, и также выдержали 2 ч. По истечении этого срока цыплята обоих групп были возвращены в клетки. У них отбирали пробы крови через 3, 4 и 96 ч от начала опыта.

Другой опыт осуществили на 18-дневных цыплят, отобранных по методу аналогов. Особи опытной группы в течение 24 часов не получали корм и воду. В остальном режим содержания, микроклимат, рацион кормления и поения, методика определения искомых показателей были идентичны условиям предыдущего опыта. До голодания и жажды, а также через 24, 32 и 110 ч от начала опыта отбирали пробы крови.

Полученные данные обработаны методами вариационной статистики с использованием критерия Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТЫ

В покое у 20-дневных цыплят величина МАЛ составила в среднем 6,0±1,0 мм. После выдерживания цыплят при пониженной температуре величина этого показателя существенно уменьшилась. Так, через 3 и 48 часов от начала опыта – 5,97± 0,87 и 2,1± 0,43 мм, а в контроле соответственно 6,52± 0,91 и 6,4±1,0 мм.

Величина соотношения Г/Л также изменилась в результате действия стресс-фактора. Так, через один час после прекращения действия холода величина Г/Л у контрольных равнялась 0,40± 0,11, а у опытных увеличивалась до 0,65± 0,10 (Р<0,05).

Достоверность различий величины МАЛ и Г/Л в контрольной и опытной группах констатирована также в течение вторых суток после воздействия. И только к концу четвертых суток величины искомых маркеров стресса практически восстановились до уровня нормы.

Сразу после суточного голодания и жажды цыплят обнаружено уменьшение МАЛ на 48,1 процента. По прошествии еще 8 ч величина МАЛ практически осталась без изменений и только через 110 ч после начала опыта показатель достиг величины, соответствующей состоянию покоя.

Закономерность изменения величины соотношения Г/Л в результате суточного голодания и жажды подобна изменениям, отмеченным после выдерживания цыплят при пониженной температуре.

Таким образом, известный и широко апробированный способ, основанный на наблюдении за изменением величины соотношения Г/Л в периферической крови и апробированный нами маркер – кинетика миграционной активности циркулирующих лейкоцитов закономерно изменялись при развитии постстрессной реакции у цыплят.

Однако, направленность кинетики этих двух маркеров состояния напряжения неодинакова: величина Г/Л увеличивается, а МАЛ – уменьшается при стрессе.

Практическое использование обоих способов свидетельствует, что эффективность у них примерно одинакова. Все же, по нашему мнению, диагностика стресса путем наблюдения за МАЛ имеет ряд преимуществ по сравнению с соотношением Г/Л. В частности, первый способ менее трудоемок, т.к. не требует микроскопии мазков под иммерсией и более доступен персоналу ветеринарных лабораторий птицефабрик, владеющему навыками постановки серологических реакций.

На основе изложенных выше наблюдений, проведенных совместно с проф. Скутарь И.Г., разработан способ диагностики состояния стресса птиц, защищенный авторским свидетельством на изобретение 739408.

Формула изобретения: Способ определения состояния стресса у птиц путем исследования проб периферической крови, отличающийся тем, что с целью повышения точности определения и его упрощения, устанавливают уровень миграционной активности лейкоцитов до и после действия стрессового фактора, сравнивают их и по отклонению от нормы судят о наличии общего адаптационного синдрома.

В исследованиях, посвященных изучению стресса и адаптации птиц, широко используется один из косвенных физиологических тестов – кинетика величины соотношения гетерофилов и лимфоцитов (Г/Л) периферической крови. Установлено, что при развитии состояния стресса этот показатель увеличивается за счет абортивного выброса незрелых клеток гетерофилов из костного мозга в кровяное русло и миграции лимфоцитов из последнего в ткани. Причем, изменения величины соотношения Г/Л коррелируют с сдвигом концентрации кортикостерона в крови птиц и пропорциональны степени действия стресс-факторов различной природы (вакцинация, плотность посадки, параметры микроклимата).

Доказано, что соотношение Г/Л более объективный тест, чем кинетика концентрации этого «гормона стресса», т.к. величина данного соотношения менее лабильна, а собственно процедура отбора проб крови не вызывает изменений соотношения этих клеток, как происходит с кортикостерона. Кроме того, гормональный статус имеет циркадный ритм, а у несушек определяется еще и фазой формирования яйца.

Перспективными в качестве маркеров стресса являются показатели активности иммунной системы, состояние которой, как известно, существенно изменяется при развитии общего адаптационного синдрома. При этом, например, нарушается синтез интерлейкинов и соответственно кооперация различных популяций лимфоцитов.

Нами предложен способ диагностики состояния стресса у птиц, защищенный авторским свидетельством на изобретение, который основан на определении изменений миграционной активности лейкоцитов (МАЛ) периферической крови.

Для определения информативности указанных выше способов проведен опыт на 20-дн. цыплятах (П-46), отобранных по методу аналогов. В качестве стресс-факторов использовали 24-часовое голодание и жажду, а также охлаждение особей при температуре 10⁰С в течение 2 ч. В состоянии покоя величина МАЛ составила в среднем 6,0±1,0 мм, а после выдерживания цыплят при пониженной температуре уменьшилась до 5,97±0,87 и 2,1±0,43 мм через 3 и 48 ч соответственно. Величина соотношения Г/Л при нормальных условиях равнялась 0,41±0,09, а после действия температуры ниже комфортного диапазона увеличилась до 0,65± 0,10 (P<0,05).

Достоверность различий средних величин Г/Л и МАЛ в контрольной и опытной группах констатирована в течение вторых суток после воздействия и только к концу четвертых суток величины использованных маркеров стресса восстановились до уровня нормы.

______________
e-mail: zabudsky@mail.ru

Можно заключить, что информативность искомых способов диагностики стресса у птиц практически одинакова. Однако, по мнению автора, диагностика стресса посредством МАЛ имеет преимущества по сравнению с Г/Л. Так, первый способ менее трудоемок, т.к. не требует микроскопии мазков под иммерсией и более доступен специалистам производства и персоналу лабораторий птицефабрик, имеющих навык постановки серологических реакций.